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影響電泳實驗結果分析


影響電泳實驗結果分析
  不同的帶電顆粒在同一電場中電泳加工的速度不同。常用電泳加工度(或遷移率)來表示。電泳加工度是指帶電顆粒在單位電場強度下泳的速度。
影響電泳加工度的主要因素有:
1、首先決定于帶顆粒的性質,即顆粒所帶凈電荷的數量,大小及形狀
  一般說來,顆粒帶凈電荷多,直徑小而接近于球形,則在電場中電泳加工速度快,反之則慢。電泳加工度還與分子的形狀,介質粘度,顆粒所帶電荷有關,電泳加工度與顆表面電荷成正比,與介質粘度及顆粒半徑反比。帶電荷的高分子在電解質溶液中把一些帶有相反電荷的離子吸引在其周圍,形成一離子擴散層。加以電場時,顆粒向符號相反的電極移動即帶陽電荷顆粒移向負極,帶陰電荷顆粒移向正移;離子擴散層由于帶有過剩的與顆粒符號相反的電荷,可以向相反方向移動。結果顆粒與離子擴散之間的靜電引力使顆粒的電泳加工度減慢,另外,高分了顆粒表面有一層水,在電場影響下,它與顆粒一起移動,可以認為是顆粒的一部分。
2、電場強度
  電場強度也稱電位梯度,是指單位長度(每一厘米)支持物體上的電位降,它對電泳加工度起著十分重要的作用。例如紙電泳。測量25厘米長紙條兩端電壓為250伏特,則電場強度為250伏特/25厘米=10伏特/厘米。
  一般,電場強度越高,帶電顆粒移動速度越快。根據電場強度大小,可將電泳分為常壓電泳和高壓電泳,前者的電壓在100-500伏特,電場強度一般是2-10伏特/厘米;后者電壓可高達500-1000伏特,電場強度在200-2000伏特/厘米。常壓電泳分離時間需數小時至數天,高壓電泳時間短,有時僅幾分鐘即可,高壓電泳主要用于分離氨基酸,肽,核苷酸,由于電壓升高,電壓也隨之增大,故需冷卻裝置。
3、電滲作用 
  在支持物的電泳中,影響電泳的另一個重要因素是電滲作用。所謂電滲就是指在電場中液體對固體支持物的相對移動,例如在pH8.6時,血清蛋白質進行紙電泳時,γ球蛋白與其他蛋白質一樣帶負電荷,應該向正極移動,然而它卻向負極方向移動,這就是電滲作用的結果。濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負電荷,如一束毛細管,進行電泳時蛋白質通過這些孔隙向前移動。紙的孔隙帶有負電荷,與帶電顆粒一樣可以吸引正離子,因此介質沿管壁相對地帶的較多的正電荷。在電場中,帶負電荷的蛋白質向正極移動,而介質卻向反向陰極移動,從而對蛋白質顆粒的電泳加工起阻礙作用。由于γ球蛋白分子顆粒大,凈電荷較少,移動速度慢,電滲作用大于顆粒向前電泳加工的力,結果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白質,因分子較小,凈電荷較多,電滲作用小于分子向前移動的力,因此分子向前移。所以,血清蛋白質電泳后球蛋白反而在點樣位置之后。
4、溶液的pH值
  溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度,也決定了物質所帶凈電荷的多少,對于蛋白質,氨基酸等兩性電解質而言,溶液pH值離電點越遠,顆粒所帶凈電荷越多;電泳速度越快;反之則越慢。例如血清中幾種主要蛋白質的等電點各不相同,白蛋白等電點是4.0。α2球蛋白等電點是5.06,β球蛋白等電點是5.1,γ球蛋白等電點是7.1。當在pH8.6的電泳緩沖液中電泳時,這些蛋白質都帶負電荷,它們的電泳加工速度是白蛋白< α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。因此,當要分離一種蛋白質混合物時,應選擇一種能擴大各種蛋白質所帶電荷量差異的pH值,以利于各種蛋白質分子的解離。同時,為保持電泳過程中溶液pH恒定也須使用緩沖液。
5、溶液的離子強度
  溶液的離子強度是另一個重要選擇的條件,在保持足夠緩沖能力前提下,離子強度要最小。溶液的離子強度越高,帶電顆粒電泳加工速度越慢,反之越快。濃度大的緩沖液在合適電壓下,有較低的電阻和較大的電流,產熱較高。如果這種額外的熱可以驅散,高濃度的緩沖液擴散常數較低,可以產生較窄細的電泳區帶。離子強度很高時要用低電壓,避免過多產熱,這樣又導致長的電泳時間,以致增加變性和區帶分離困難。
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